PCR, ialah tindak balas rantai polimerase, yang merujuk kepada penambahan dNTP, Mg2+, faktor pemanjangan dan faktor peningkatan amplifikasi kepada sistem di bawah pemangkinan polimerase DNA, menggunakan DNA induk sebagai templat dan primer khusus sebagai titik permulaan lanjutan , Melalui langkah denaturasi, penyepuhlindapan, lanjutan, dsb., proses mereplikasi DNA untai anak perempuan secara in vitro yang melengkapi DNA templat untai induk boleh dengan cepat dan khusus menguatkan mana-mana DNA sasaran secara in vitro.
1. PCR Mula Panas
Masa mula penguatan dalam PCR konvensional bukan untuk meletakkan mesin PCR ke dalam mesin PCR, dan kemudian program mula menguatkan.Apabila konfigurasi sistem selesai, penguatan bermula, yang mungkin menyebabkan penguatan tidak khusus, dan PCR permulaan panas boleh menyelesaikan masalah ini.
Apakah PCR permulaan panas?Selepas sistem tindak balas disediakan, pengubah suai enzim dilepaskan pada suhu tinggi (biasanya lebih tinggi daripada 90°C) semasa peringkat pemanasan awal tindak balas atau peringkat "permulaan panas", supaya polimerase DNA diaktifkan.Masa pengaktifan dan suhu yang tepat bergantung pada sifat polimerase DNA dan pengubah permulaan panas.Kaedah ini menggunakan pengubah suai seperti antibodi, ligan afiniti atau pengubah kimia untuk menghalang aktiviti polimerase DNA.Memandangkan aktiviti polimerase DNA dihalang pada suhu bilik, teknologi permulaan panas memberikan kemudahan yang besar untuk menyediakan pelbagai sistem tindak balas PCR pada suhu bilik tanpa mengorbankan kekhususan tindak balas PCR.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse transcription PCR) ialah teknik eksperimen untuk transkripsi terbalik daripada mRNA ke dalam cDNA dan menggunakannya sebagai templat untuk amplifikasi.Prosedur eksperimen adalah untuk mengekstrak jumlah RNA dalam tisu atau sel terlebih dahulu, menggunakan Oligo (dT) sebagai primer, menggunakan transkripase terbalik untuk mensintesis cDNA, dan kemudian menggunakan cDNA sebagai templat untuk penguatan PCR untuk mendapatkan gen sasaran atau mengesan ekspresi gen.
3. PCR kuantitatif pendarfluor
PCR kuantitatif pendarfluor (PCR Kuantitatif Masa Nyata,RT-qPCR) merujuk kepada kaedah menambah kumpulan pendarfluor pada sistem tindak balas PCR, menggunakan pengumpulan isyarat pendarfluor untuk memantau keseluruhan proses PCR dalam masa nyata, dan akhirnya menggunakan lengkung standard untuk menganalisis templat secara kuantitatif.Kaedah qPCR yang biasa digunakan termasuk SYBR Green I dan TaqMan.
4. PCR bersarang
PCR bersarang merujuk kepada penggunaan dua set primer PCR untuk dua pusingan penguatan PCR, dan produk penguatan pusingan kedua ialah serpihan gen sasaran.
Jika ketidakpadanan pasangan primer pertama (primer luar) menyebabkan produk bukan spesifik dikuatkan, kemungkinan kawasan bukan spesifik yang sama dikenali oleh pasangan primer kedua dan terus menguatkan adalah sangat kecil, jadi amplifikasi oleh pasangan primer kedua, kekhususan PCR telah dipertingkatkan.Satu kelebihan melakukan dua pusingan PCR ialah ia membantu untuk menguatkan produk yang mencukupi daripada DNA permulaan yang terhad.
5. PCR sentuh
Touchdown PCR ialah kaedah untuk meningkatkan kekhususan tindak balas PCR dengan melaraskan parameter kitaran PCR.
Dalam PCR sentuh, suhu penyepuhlindapan untuk beberapa kitaran pertama ditetapkan beberapa darjah di atas suhu penyepuhlindapan maksimum (Tm) primer.Suhu penyepuhlindapan yang lebih tinggi boleh mengurangkan penguatan bukan spesifik secara berkesan, tetapi pada masa yang sama, suhu penyepuhlindapan yang lebih tinggi akan memburukkan lagi pemisahan primer dan jujukan sasaran, mengakibatkan hasil PCR berkurangan.Oleh itu, dalam beberapa kitaran pertama, suhu penyepuhlindapan biasanya ditetapkan untuk menurun sebanyak 1°C setiap kitaran untuk meningkatkan kandungan gen sasaran dalam sistem.Apabila suhu penyepuhlindapan diturunkan kepada suhu optimum, suhu penyepuhlindapan dikekalkan untuk kitaran yang tinggal.
6. PCR langsung
PCR langsung merujuk kepada penguatan DNA sasaran terus daripada sampel tanpa memerlukan pengasingan dan penulenan asid nukleik.
Terdapat dua jenis PCR langsung:
kaedah langsung: ambil sedikit sampel dan tambahkannya terus ke Campuran Induk PCR untuk pengenalan PCR;
kaedah retak: selepas mensampel sampel, tambahkannya ke lisat, lisis untuk melepaskan genom, ambil sedikit supernatan terlisis dan tambahkannya ke Campuran Induk PCR, lakukan pengecaman PCR.Pendekatan ini memudahkan aliran kerja eksperimen, mengurangkan masa praktikal dan mengelakkan kehilangan DNA semasa langkah penulenan.
7. PCR SOE
Penyambungan gen dengan sambungan PCR bertindih (SOE PCR) menggunakan primer dengan hujung pelengkap untuk menjadikan produk PCR membentuk rantai bertindih, supaya dalam tindak balas penguatan seterusnya, melalui lanjutan rantai bertindih, sumber teknik A yang berbeza di mana serpihan yang dikuatkan bertindih. dan disambung bersama.Teknologi ini pada masa ini mempunyai dua arah aplikasi utama: pembinaan gen gabungan;mutasi terarah tapak gen.
8. IPCR
Inverse PCR (IPCR) menggunakan primer pelengkap terbalik untuk menguatkan serpihan DNA selain daripada dua primer, dan menguatkan jujukan yang tidak diketahui pada kedua-dua belah serpihan DNA yang diketahui.
IPCR pada asalnya direka untuk menentukan jujukan kawasan yang tidak diketahui bersebelahan, dan kebanyakannya digunakan untuk mengkaji jujukan promoter gen;penyusunan semula kromosom onkogenik, seperti gabungan gen, translokasi dan transposisi;dan penyepaduan gen virus, juga biasa digunakan sekarang Untuk mutagenesis terarah tapak, salin plasmid dengan mutasi yang diingini.
9. dPCR
Digital PCR (dPCR) ialah teknik untuk pengiraan mutlak molekul asid nukleik.
Pada masa ini terdapat tiga kaedah untuk kuantifikasi molekul asid nukleik.Fotometri adalah berdasarkan penyerapan molekul asid nukleik;PCR kuantitatif pendarfluor masa nyata (PCR Masa Nyata) adalah berdasarkan nilai Ct, dan nilai Ct merujuk kepada nombor kitaran sepadan dengan nilai pendarfluor yang boleh dikesan;PCR digital ialah teknologi Kuantitatif terkini berdasarkan kaedah PCR molekul tunggal untuk mengira kuantifikasi asid nukleik adalah kaedah kuantitatif mutlak.
Masa siaran: Jun-13-2023